為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。

　　2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）組成的。一旦兩種細(xì)胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件，例如與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測定。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長，惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗癌化合物后，我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

　　ibidi腫瘤細(xì)胞2D侵襲檢測方案實驗流程：　　

　　01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中，在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中。　　

　　02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們，以去除死細(xì)胞和碎片。　　

　　03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘，然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng)。　　

　　04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，并用臺式離心機(jī)（1500xg,5′,RT）短暫離心。　　

　　05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中；將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺盼藍(lán)溶液混合，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)活細(xì)胞。　

　　06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞。　　

　　07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養(yǎng)插件）。　　

　　08. 用75µl（3x104細(xì)胞）FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè)，并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè)。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞，以確保細(xì)胞*分布。　　

　　09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中，放置過夜。　　

　　10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件，并用PBS清洗。　　

　　11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基。　

　　12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)。　　

　　13. 一旦每個孔中的間隙*閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層。　

　　14. 小心地除去培養(yǎng)基，并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養(yǎng)基。將板放在培養(yǎng)箱中24小時（處理孵育時間）。　　

　　24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上）的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化。

　　將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。