小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級(jí)2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個(gè)特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時(shí)間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。

　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備　　

　　在將細(xì)胞接種到玻片中之前，按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。　　

　　µ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。這對(duì)于避免隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 µ-Slide 8孔載玻片開(kāi)放孔井中，氣泡可排出到大氣中。　　

　　拆開(kāi)µ-Slide的包裝，把它放在µ-Slide支架上，并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時(shí)同時(shí)將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　2.播種細(xì)胞

　　分離細(xì)胞：　　

　　吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。　　

　　2.1. 將細(xì)胞接種到µ-Slide VI 0.4中　　

　　在µ-Slide VI 0.4建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 5 cells/cm2，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過(guò)將移液器底部直接放在通道的入口上，將30 µl細(xì)胞懸浮液填充到每個(gè)通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時(shí)以固定細(xì)胞。　

　　細(xì)胞貼壁后，分別用60 µl無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲(chǔ)液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。　　

　　圖1：接種后一小時(shí)，在ibiTreat µ-Slide VI 0.4（貨號(hào)80606）中的RAW-264.7　　

　　圖2: 在ibiTreat µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后　　

　　圖3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后

　　2.2 將細(xì)胞播種在µ-Slide 8 well 中　　

　　在µ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm2 ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 µl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

　　圖4：在ibiTreat µ-Slide 8 well(貨號(hào)：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時(shí)　　

　　圖5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后

　　圖6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過(guò)四天的培養(yǎng)

　　為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞，我們建議使用像µ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細(xì)胞密度可能會(huì)在孔的整個(gè)表面上因點(diǎn)而異，具體取決于細(xì)胞播種過(guò)程中的處理。

　　3. 免疫熒光染色　　

　　像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。　　

　　注意：在 µ-Slides 中染色時(shí)注意液體的處理　　

　　µ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個(gè)儲(chǔ)液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備，請(qǐng)注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液，通過(guò)通道流入另一個(gè)儲(chǔ)液池，然后從另一側(cè)吸出，直到兩個(gè)儲(chǔ)液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸！　　

　　µ-Slide 8孔載玻片：在 µ-Slide 8孔中，無(wú)需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。